Quantitative PCR (qPCR) - Durchführung, Interpretation und Troubleshooting - Webinar von Dr. Klinkner & Partner GmbH

qPCR Grundlagen

• Funktionsprinzip einer qPCR
• Vergleich PCR (Northern Blot), qPCR mit Stärken und Schwächen
• Funktionsprinzip der verschiedenen Detektionsreagenzien (Farbstoff, Sonde)
• Anwendungsfälle einer qPCR mit kurzen Beispielen anhand von Kundenfällen
• Wo macht es Sinn, wo nicht?
• Gängige qPCR-Geräte und -Verbrauchsmaterialien
• Typische Kosten eines qPCR-Assays
• Kostenvergleich mit End-Punkt PCR, NGS
• qPCR-Parameter
• Phasen, Cq, Fluoreszenz
• Schmelzkurven
• Wie und warum?
• Wie werden Proben miteinander verglichen?

qPCR Assay Design

• Wie designe/etabliere ich einen qPCR-Assay?
• Worauf muss ich bei einer reversen Transkription achten?
• Primer, Amplikons
• Multiplexing
• Notwendige Kontrollen
• Referenzgene - How To
• Protokoll und Handling eines qPCR-Assays
• 1-Step vs. 2-Step qPCR

qPCR Assay Validation

• Was sagen uns die Kontrollen?
• Welche qPCR-Parameter kann ich als Qualitätskontrolle des Assays verwenden?
• Linear Dynamic Range und Primer Efficiency
• Ist ein Agarosegel zur Assayvalidierung notwendig?
• Darf man Reagenzien innerhalb einer Versuchsreihe austauschen?

qPCR Troubleshooting (Beispiele, Modelle)

• PCR-Inhibition
• Welchen Einfluss hat die DNA/cDNA Konzentration?
• Replikate (technisch/biologisch)
• Niedrige Fluoreszenzwerte/Baseline
• Was sagen Schmelzkurven über die Assayqualität?
• Welcher Einfluss hat die Primer Konzentration?

Datenanalyse

• Verfügbare Software
• Strategien / Modelle zur Datenauswertung
• PCR-Effizienz pro Reaktion berechnen
• ddCt
• Relative Quantities
• Effizienzkorrektur
• ddCt vs. Relative Quantities

Nach dem Seminar - haben Sie die Grundlagen einer quantitativen PCR aufgefrischt und die Besonderheiten, Stärken und Schwächen der Messtechnik erhalten. - haben Sie gelernt, wie ein qPCR Assay designed, etabliert und validiert wird. - sind Ihnen Beispiele für typische Fehlerquellen sowie deren Lösungen bekannt und Sie sind in der Lage diese Lösungsansätze in Ihr Labor zu übertragen. - haben Sie einen Überblick über gängige Methoden zur Datenauswertung, die anhand von Rechenbeispielen vertieft wurden, erhalten.

Für wen ist das Seminar interessant - Technische und wissenschaftliche Mitarbeitende aus der akademischen, industriellen und klinischen Forschung. - Mitarbeitende aus der Qualitätkontrolle und Assayentwicklung, die nukleinsäure-basierte Verfahren anwenden.